Xét nghiệm sinh học phân tử: Giải trình tự gen

Giải trình tự gen nhằm mục đích gì?

• Xác định các biến đổi gen “dẫn đường” trong khối u để chọn liệu pháp đích/miễn dịch phù hợp
• Phát hiện cơ chế kháng thuốc mắc phải
• Phát hiện hội chứng ung thư di truyền
• Theo dõi bệnh tồn dư tối thiểu (MRD) hay tái phát sau điều trị qua sinh thiết lỏng (ctDNA)
• Hỗ trợ phát hiện nguồn gốc u trong trường hợp mô bệnh học và lâm sàng chưa xác định được nguồn gốc.

Vai trò của giải trình tự gen trong chẩn đoán và điều trị ung thư hiện nay

Hiện nay, giải trình tự gen thế hệ mới (NGS) đã trở thành tiêu chuẩn trong nhiều ung thư tiến xa (ví dụ NSCLC, đại trực tràng, vú, melanoma) nhằm lập hồ sơ phân tử - cá thể hóa trước điều trị, giúp bệnh nhân tăng khả năng tiếp cận thuốc đích và thử nghiệm lâm sàng. Ngoài phát hiện các biến đổi gen đích đặc hiệu ở từng cơ quan, NGS cũng giúp phát hiện các chỉ định “tissue-agnostic” như thuốc cho u có NTRK fusion hoặc MSI-H (mất ổn định vi vệ tinh mức độ cao), TMB (tải lượng đột biến trong u) cao . Các nghiên cứu và thực hành lâm sàng cho thấy bệnh nhân được điều trị cá thể hóa dựa trên biến đổi gen đích từ phân tích hồ sơ phân tử có tỉ lệ sống còn tốt hơn so với phác đồ không sử dụng biến đổi gen đích. Tại các trung tâm hàng đầu, NGS mô và NGS máu (sinh thiết lỏng) được ứng dụng song hành để mở rộng cơ hội điều trị, theo dõi đáp ứng và phát hiện sớm kháng thuốc.

Các dạng xét nghiệm NGS phổ biến

• Panel giải trình tự gen mục tiêu (targeted gene panels): tùy theo bệnh cảnh lâm sàng và loại u nguyên phát,  mang lại hiệu suất cao trong thực hành thường quy, tiết kiệm chi phí. Panel mục tiêu thường bao phủ < 50 gen đích quan trọng nhất, liên quan trực tiếp đến cơ chế phát sinh và cơ chế kháng thuốc của khối u. Một số panel rộng bao phủ nhiều gen mục tiêu hơn (khoảng 100 đến hơn 500 gen).
• Giải trình tự toàn bộ exome/ genome (WES/WGS) sử dụng nhiều trong nghiên cứu, một số trường hợp lâm sàng đặc biệt như ung thư không rõ nguyên phát có thể hưởng lợi từ WGS.

2. QUY TRÌNH THỰC HIỆN KĨ THUẬT NGS TẠI BỆNH VIỆN

Chuẩn bị loại mẫu làm xét nghiệm

• Mẫu mô: Ưu tiên mẫu mô (sinh thiết u/ bệnh phẩm mổ u) cố định formalin  đúc paraffin (FFPE) đạt chuẩn tiền phân tích (đúng nồng độ/pH formalin trung tính, thời gian cố định phù hợp, lát cắt đủ tế bào u). Bác sĩ giải phẫu bệnh sẽ soi kính hiển vi chọn lọc vùng giàu tế bào u trên mẫu mô để tách chiết, giúp tăng độ nhạy phát hiện đột biến. Chất lượng DNA/RNA FFPE phụ thuộc chặt chẽ khâu tiền phân tích này, và đóng vai trò quan trọng trong độ chính xác của kết quả NGS.
• Mẫu máu (sinh thiết lỏng): Mẫu máu lấy từ bệnh nhân được đưa lưu trữ trong ống máu chuyên dụng để phân tích cfDNA/ctDNA. Sinh thiết lỏng rất hữu ích khi khó tiếp cận mẫu mô, mẫu mô nghèo tế bào u hoặc khi cần theo dõi động học đáp ứng hoặc cơ chế kháng thuốc theo thời gian. Tuy nhiên độ nhạy của sinh thiết lỏng tùy thuộc tải lượng đột biến u và giai đoạn bệnh.

Quy trình chung của kỹ thuật giải trình tự gen

Giải trình tự gen thế hệ mới được xây dựng trên nguyên lý giải trình tự song song. Quy trình cơ bản gồm bốn bước:

1.     Lựa chọn panel giải trình tự gen: bác sĩ lâm sàng ung thư xem xét kĩ lưỡng chẩn đoán lâm sàng, giải phẫu bệnh, giai đoạn bệnh kết hợp hướng dẫn chẩn đoán-điều trị của Bộ Y tế và các Hiệp hội ung thư uy tín trên thế giới (NCCN, ESMO, ASCO,…) sau đó trao đổi và tư vấn bệnh nhân để lựa chọn panel giải trình tự gen phù hợp.

2.     Tiếp nhận và thẩm định mẫu: bác sĩ giải phẫu bệnh xác nhận chẩn đoán mô bệnh học trên mẫu mô nhận được, ước lượng tỉ lệ tế bào u, chọn vùng mô u tối ưu.

3.     Tách chiết và kiểm soát chất lượng: DNA/ RNA từ khối u hoặc máu của bệnh nhân được tách chiết và cắt nhỏ thành hàng triệu đoạn. Kiểm tra nồng độ, độ tinh sạch và độ phân mảnh DNA bằng các loại  máy chuyên dụng. 

4.     Tạo thư viện và khuếch đại: Các đoạn DNA sau khi được gắn thêm adapter để nhận diện, sẽ được cố định lên bề mặt chip hoặc hạt từ, sau đó được khuếch đại lên thành những cụm trên bề mặt khay vi mô bằng phản ứng PCR cầu hoặc dạng hạt, giúp tạo ra đủ tín hiệu để máy đọc nhận biết.

5.     Giải trình tự bằng tổng hợp: Máy giải trình tự thêm các nucleotide đánh dấu huỳnh quang vào mỗi cụm DNA theo từng chu kỳ. Khi mỗi nucleotide được bổ sung, thiết bị chụp ảnh tín hiệu huỳnh quang để xác định chữ cái DNA tương ứng; việc này lặp lại hàng trăm chu kỳ sẽ tạo ra dãy nucleotide của mỗi đoạn. Công nghệ Illumina hiện là nền tảng phổ biến nhất nhờ độ chính xác và thông lượng cao. Ngoài ra, hiện nay trên thế giới còn có công nghệ Iron torrent nhận biết trình tự nucleotid thông qua sự biến đổi ion H+.

6.     Phân tích dữ liệu bậc 1 và bậc 2: Máy trả về hàng triệu đoạn đọc (reads). Phần mềm tin sinh học tính toán gắn kết chúng vào bộ gen tham chiếu và xác định các biến thể. Quá trình xử lí này dựa trên lượng dữ liệu khổng lồ, đòi hỏi thuật toán tinh vi và hạ tầng lưu trữ tin học mạnh.

7.     Phân tích dữ liệu bậc 3 (Xác nhận và tạo báo cáo kết quả NGS): Bác sĩ chuyên khoa Giải phẫu bệnh - Sinh học phân tử tham gia vào bước phân tích cuối cùng, rà soát, lồng ghép bối cảnh bệnh học - lâm sàng, xác định các biến đổi gen đích có ý nghĩa, hữu ích cho điều trị và chẩn đoán, tiên lượng bệnh. Từ đó đưa ra bình luận và khuyến nghị hướng điều trị/ cận lâm sàng bổ sung. Thời gian trả kết quả thông thường 7-14 ngày tùy thuộc loại panel gen đích.

Mỗi khối u lại mang hồ sơ phân tử riêng biệt với nhiều loại biến đổi gen khác nhau, cùng với sự phát triển từng ngày của khoa học và y học chính xác, ngày càng phát hiện thêm nhiều gen đột biến liên quan cơ chế sinh ung thư và kháng thuốc, cũng như các thử nghiệm lâm sàng với thuốc điều trị nhắm gen đích đầy triển vọng. Điều này đòi hỏi kiến thức sinh học phân tử chuyên sâu và cập nhật hướng dẫn chẩn đoán, điều trị liên tục từ các chuyên gia giải phẫu bệnh - sinh học phân tử trong quá trình phân tích dữ liệu NGS. Kết quả NGS được thảo luận tại hội chẩn đa chuyên khoa (MDT)/ hội chẩn hồ sơ phân tử khối u (MTB) để tối ưu hóa quyết định điều trị cho từng người bệnh.

Ưu điểm của NGS là có thể giải trình tự hàng triệu đoạn DNA đồng thời, giúp giảm thời gian và chi phí. Độ sâu đọc cao cho phép phát hiện các biến thể gen chỉ xuất hiện ở vài phần trăm tế bào của mẫu. Công nghệ này có thể giải mã toàn bộ bộ gen (WGS), toàn bộ vùng mã hóa (WES) hoặc nhóm gen mục tiêu. So với phương pháp giải trình tự Sanger, NGS có năng suất cao hơn nhiều và ít hạn chế về kích thước vùng đọc. Tuy nhiên, NGS vẫn gặp khó ở các vùng giàu GC hoặc lặp lại dài, vì vậy đôi khi cần kết hợp Sanger hoặc công nghệ đọc dài.

3. LỢI ÍCH CỦA NGS TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ CÁ THỂ HÓA VÀ Y HỌC CHÍNH XÁC

Lợi ích lâm sàng thiết thực:

• Chọn đúng thuốc – đúng bệnh nhân: Tăng khả năng đáp ứng với thuốc đích/miễn dịch, hạn chế độc tính không cần thiết.
• Mở rộng cơ hội điều trị: Tăng khả năng phát hiện các dấu ấn sinh học không phụ thuộc loại mô u (tissue-agnostic) đã có thuốc điều trị nhắm đích như NTRK, MSI-H, TMB. Việc phát hiện các đột biến gen mới từ kết quả NGS, vốn là đích điều trị mới của các thử nghiệm lâm sàng cũng giúp bệnh nhân có thêm lựa chọn điều trị đầy hứa hẹn.
• Theo dõi tái phát và phát hiện kháng thuốc: Sinh thiết lỏng cho phép theo dõi kháng thuốc theo thời gian thực, phát hiện bệnh tồn dư tối thiểu (MRD), đặc biệt hay sử dụng trong bệnh lý huyết  học ác tính và nhiều ung thư đặc như ung thư phổi không tế bào nhỏ. 
• Cải thiện kết quả điều trị: Dữ liệu  từ thực tế và các nghiên cứu cho thấy điều trị theo hội chẩn hồ sơ phân tử của khối u giúp cải thiện đáng kể thời gian sống và thời gian không tiến triển bệnh cho bệnh nhân ung thư.

Giá trị chăm sóc toàn diện tại Bệnh viện Ung Bướu Hà Nội:

Bệnh viện Ung Bướu Hà Nội là bệnh viện công lập, chuyên sâu, tuyến cuối chuyên ngành ung bướu, tiếp nhận khám và điều trị các bệnh lý ung bướu. Năng lực khám – điều trị toàn diện gồm nội khoa, ngoại khoa, xạ trị, y học hạt nhân, chăm sóc giảm nhẹ, can thiệp điện quang,… giúp bệnh viện triển khai lộ trình điều trị cá thể hóa dựa trên hồ sơ phân tử một cách hiệu quả. Hội chẩn chuyên môn định kỳ, hợp tác trong nước – quốc tế, phối hợp thực hiện nhiều thử nghiệm lâm sàng, nghiên cứu khoa học và thường xuyên cập nhật, ứng dụng các tiến bộ trong điều trị liệu pháp miễn dịch, thuốc nhắm trúng đích dựa trên hồ sơ phân tử khối u của từng bệnh nhân (tổng hợp từ kết quả NGS, qPCR, Hóa mô miễn dịch), góp phần nâng cao chất lượng điều trị và cải thiện chất lượng sống của người bệnh.

Khi nào nên làm giải trình tự gen?

Giải trình tự gen trong ung thư được chỉ định khi:

• Cần chọn thuốc điều trị đích hoặc miễn dịch. Đặc biệt trong ung thư giai đoạn tiến xa/di căn cần lựa chọn liệu pháp điều trị hệ thống bước đầu hoặc sau thất bại điều trị trước đó (Ví dụ ung thư phổi không tế bào nhỏ, ung thư đại trực tràng, ung thư vú,…)
• Trường hợp nghi hội chứng ung thư di truyền cần tư vấn di truyền và xét nghiệm phù hợp, với quy trình đồng thuận và bảo mật dữ liệu người bệnh.
• Cần khẳng định phân loại u đặc biệt/hiếm (nghi ngờ nhưng không khẳng định được trên mô bệnh học và hóa mô miễn dịch, nhưng có biến đổi gen đích đặc trưng).
• Cần đánh giá tiên lượng, cơ chế kháng thuốc mắc phải, hoặc cần mở rộng khảo sát để định hướng điều trị tiếp theo.
• Cần đánh giá  hoạt tính các gen tham gia chuyển hóa thuốc, nhằm nhận biết các trường hợp có nguy cơ rối loạn chuyển hóa thuốc, dự báo độc tính có thể gặp phải khi điều trị hóa chất, từ đó điều chỉnh liều hoặc thay đổi loại thuốc, hạn chế tối đa độc tính thuốc có thể gặp trên người bệnh.
• Cần tìm cơ hội tham gia thử nghiệm lâm sàng

Câu hỏi thường gặp

• Bao lâu có kết quả NGS? Thông thường 7–14 ngày làm việc tùy chất lượng mẫu và phạm vi panel gen đích.
• Có cần sinh thiết lại để làm NGS không? Có thể dùng khối nến mẫu mô (FFPE) sẵn có nếu đạt chuẩn chất lượng; nếu mẫu mô quá cũ, ít tế bào u hoặc không đủ chất lượng, bác sĩ có thể khuyến nghị sinh thiết bổ sung hoặc sinh thiết lỏng (lấy máu người bệnh).
• NGS máu có thay thế NGS mô không? Không, hai phương pháp này bổ trợ cho nhau. NGS mô vẫn là chuẩn vàng để chẩn đoán và lập hồ sơ phân tử khối u. NGS máu giúp theo dõi, phát hiện sớm kháng thuốc hoặc bệnh tái phát, tiến triển.
• Bảo hiểm/Chi phí bệnh nhân cần chi trả? Tùy loại xét nghiệm. Bệnh viện sẽ tư vấn gói xét nghiệm phù hợp bệnh cảnh và khả năng chi trả của bệnh nhân, đồng thời cân nhắc hiệu quả – chi phí dựa trên lợi ích điều trị dự kiến.
• Nếu muốn làm xét nghiệm NGS, bệnh nhân cần liên hệ ai? Khi có nhu cầu tìm hiểu và làm xét nghiệm NGS, cần liên hệ với bác sĩ lâm sàng ung thư trực tiếp điều trị cho người bệnh để được tư vấn. Tùy thuộc vào loại ung thư, giai đoạn, phác đồ điều trị và loại thuốc điều trị hiện hành tại Việt Nam, hiệu quả điều trị, cũng như khả năng chi trả của người bệnh, việc thảo luận giữa bác sĩ điều trị và bệnh nhân sẽ giúp đưa ra lựa chọn đúng, đủ và phù hợp nhất cho mỗi bệnh nhân.

4. KẾT LUẬN

Các kĩ thuật sinh học phân tử hiện đại trong đó có vai trò lớn của Giải trình tự gen, đã và đang thay đổi căn bản cách chẩn đoán – điều trị ung thư: từ “một phác đồ cho tất cả” sang điều trị cá thể hóa dựa trên hồ sơ phân tử. Với quy trình chuẩn hóa, đội ngũ bác sĩ giải phẫu bệnh – sinh học phân tử được đào tạo chuyên sâu, bài bản và hệ sinh thái điều trị đa mô thức, người bệnh tại Bệnh viện Ung bướu Hà Nội được hưởng lợi từ chiến lược chính xác hơn, ít độc tính hơn và cơ hội tiếp cận thuốc đích, miễn dịch trị liệu cũng như thử nghiệm lâm sàng phù hợp.

Viết bài: ThS.BSNT. Nguyễn Thu Yến - Khoa Giải phẫu bệnh - Tế bào

Duyệt bài: TS.BS. Dương Hoàng Hảo - Trưởng Khoa Giải phẫu bệnh - Tế bào